ECLIPSE Ts2-FL倒置荧光显微镜活死细胞检测(Calcein/AM-PI法)应用解决

ECLIPSE Ts2-FL倒置荧光显微镜在活/死细胞
双色荧光染色（Calcein AM / PI 法）中的应用解决方案

基于 LED 复眼透镜照明与遮光系统的标准化细胞活性检测指南

图 1：Nikon ECLIPSE Ts2-FL 倒置荧光显微镜整体结构

一、 应用背景与双色荧光检测原理

在细胞生物学、肿瘤学评估、药物毒理学及组织工程领域，准确判断细胞活力及质膜完整性是实验分析的关键基础。Calcein AM（乙氧基甲基荧光素阿醋酸酯）与 Propidium Iodide（碘化丙啶，PI）联合使用的双色荧光染色法，能够同步对同一视野下的活细胞与死细胞进行特异性标记，呈现高对比度的双色成像效果。

1.1 双色荧光探针的作用机制

二、 Ts2-FL倒置荧光显微镜核心硬件与技术支撑

针对传统荧光显微观察中存在的背景杂光干扰、激发光场不均、通道切换频繁调光以及需要暗室环境等难点，ECLIPSE Ts2-FL 倒置荧光显微镜提供了多项创新设计支撑：

2.1 LED 结合内置复眼透镜，实现均匀且高效的落射荧光照明

Ts2-FL 采用了高亮度落射荧光 LED 光源，并在光路中内置复眼透镜（Fly-eye lens）。复眼透镜能够消除光源发光不均的现象，在整个观察视场内提供高度一致的光强分布。LED 光源无需繁琐的中心校准，即开即用且发光稳定，有效避免了因光源衰减或边缘光衰导致的检测偏差。

图 2：Ts2-FL 内置落射荧光 LED 光源单元与带噪声消除机制的滤光块转盘

2.2 遮光板（Shield Plate）技术，支持在明亮室内进行高信噪比观察

传统荧光检测强依赖暗室，操作繁琐且易受环境限制。Ts2-FL 提供了可选的遮光板附件，可直接遮挡培养室或实验室内的环境光。借助该技术，实验人员无需关闭室内照明，即可直接在明亮的环境中获得高对比度、高信噪比的双色荧光图像。

图 3：遮光板（Shield Plate）阻挡室内杂光效果（左：打开遮光板；右：关闭遮光板）

2.3 自动照明强度记忆与噪声消除机制

Ts2-FL 最多可配置三个落射荧光滤光块。当在 Calcein AM（绿色）与 PI（红色）通道之间切换时，系统能自动再现使用者之前针对该通道定义的激发光强度，无需每次手动重新调节光强，既简化了操作流程，又减少了样本因长时间暴露而发生的荧光淬灭。此外，集成的噪声消除机制（Noise Terminator）可进一步吸收光路中的杂散光，显著提升成像对比度。

2.4 纤巧机身设计与优化的人体工程学面板

Ts2-FL 机身紧凑，可轻松安放于超净工作台或细胞培养罩内部。透射照明与落射荧光照明开关分别置于机身面板前侧与两侧，操作布局直观合理。机械载物台与多样化托板（如皮氏培养皿托板 C-S-HP35、通用托板 C-S-HU 等）能够稳定承载培养板、培养皿与微型板，确保微位移平稳无振动。

图 4：Ts2-FL 人体工程学控制按键与多功能机械载物台布局

三、 活/死细胞双色荧光检测标准解决方案流程

为获得重复性高、荧光漂光少且定量准确的检测结果，建议采用以下规范化操作流程：

步骤 1：试剂准备与工作液配制

• 取 Calcein AM 与 PI 储存液，使用无荧光背景的无血清培养基或 PBS 缓冲液按推荐比例稀释。

• 建议工作终浓度：Calcein AM 约 1.5–2.0 μM，PI 约 3.0–5.0 μM，现用现配，注意避光保存。

步骤 2：细胞处理与孵育染色

• 待测细胞（贴壁或悬浮细胞于 96 孔板或 35 mm 培养皿中）先用温育的 PBS 轻轻洗涤 1 次，除去培养基中血清酯酶的干扰。

• 加入配制好的 Calcein AM / PI 双染色工作液，确保覆盖细胞层。

• 置于 37°C、5% CO₂ 细胞培养箱中避光温育 15–20 分钟。

步骤 3：Ts2-FL 上样与明场/相衬区域定位

• 将培养器皿置于 Ts2-FL 载物台上，通过专用托板固定。

• 开启透射 LED 照明，切换至相差（Phase Contrast）或浮雕反差（Relief Contrast）模式，使用 10X 或 20X 物镜快速寻找代表性视野并对焦。

步骤 4：荧光通道切换与图像采集

• 展开 Ts2-FL 遮光板，阻挡环境杂散光。

• 绿色通道（Calcein AM）：切换至 GFP/FITC 滤光块，LED 荧光照明开启，系统自动再现预设光强，对焦并采集绿色胞质荧光图像（活细胞）。

• 红色通道（PI）：电动/手动滑动转盘至 TRITC/Texas Red 滤光块，采集红色胞核荧光图像（死细胞）。

步骤 5：NIS-Elements 软件叠加与定量分析

• 通过 Side Camera Port 挂载的 Digital Sight 系列数字相机（如彩色相机 DS-Fi2 / DS-Ri2）传输图像。

• 利用 NIS-Elements 图像软件完成通道叠加（Fusion）及细胞计数分析，输出活细胞比例与死细胞比例数据。

四、 典型图像结果与数据评估

在 ECLIPSE Ts2-FL 的高质量光学表现下，Calcein AM / PI 双色染色呈现出界限分明的形态与光谱特征：

图 5：使用 NIS-Elements 软件合成的多通道荧光图像（展示高清晰度与极低背景噪声）

五、 规范操作注意事项与设备保养建议

5.1 孵育时间控制：染色孵育时间不宜过长（建议控制在 15–20 分钟内）。若孵育过久，Calcein 可能逐渐渗出胞外增加背景，或 PI 少量被活细胞内吞产生假阳性。

5.2 激发光功率调节：充分利用 Ts2-FL 的光强记忆功能，在满足相机曝光的前提下适当调低 LED 激发强度，以减缓荧光探针的淬灭速度。

5.3 遮光板使用与清洁：在明亮房间观察时请确保遮光板覆盖光路。遮光板及载物台表面若沾染培养基或染色液，应用湿润无尘纸轻轻擦拭干净。

5.4 光学镜片保养：高倍物镜（如 20X、40X）前透镜表面需定期检查，如有灰尘，应用气吹或专用的无尘纸沾取无水乙醇进行清洁，保持良好的透光性能。