LF500倒置荧光显微镜Calcein AM-PI活/死细胞双色荧光染色检测解决方案

一、方案概述

1.1 Calcein AM-PI双色染色检测原理

Calcein AM-PI双染法是细胞原位活力检测的常用荧光技术，依托染料的细胞膜通透性差异、细胞代谢活性差异，区分样本中的活细胞与死细胞，适配各类贴壁细胞、悬浮细胞的活力筛查实验。

Calcein AM为脂溶性荧光染料，可穿透细胞膜进入细胞内部。具备代谢活性的活细胞内含酯酶，可水解染料中的疏水基团，使染料滞留于细胞质中，在FITC通道激发下发出绿色荧光。失去代谢活性的死细胞无酯酶作用，无法产生绿色荧光信号。

PI碘化丙啶为核酸荧光染料，难以穿透结构完整的细胞膜，仅可进入细胞膜受损的死细胞内，与细胞核核酸结合后，在TRITC通道激发下呈现红色荧光。

常规结果判定标准：活细胞呈现细胞质绿色荧光、无细胞核红色荧光；死细胞呈现细胞核红色荧光、无细胞质绿色荧光；晚期凋亡、重度损伤细胞会出现红绿双荧光信号。

1.2 LF500倒置荧光显微镜设备适配优势

莱特LF500倒置荧光显微镜搭载无限远独立校正光学系统，机身采用铝合金一体压铸成型，结构扎实、扩展性丰富，适配科研、教学、医学检验领域的细胞荧光成像实验，可良好匹配Calcein AM-PI双色染色检测的成像需求。设备多项硬件结构针对活细胞原位观测优化，各项适配特点及图文说明如下：

（1）24mm超大视场观测系统，提升批量样本筛查效率

设备标配WF10X/24mm大视场目镜，相较于常规18mm、22mm视场目镜，有效观测视野范围更大，单视野可覆盖更多细胞区域，大幅缩短多孔板、批量样本的视野寻找时间。搭配30°可360°旋转铰链式三目观察筒，瞳距48-75mm、屈光度可调节，适配不同操作人员的观测习惯，长时间实验观测不易疲劳。设备支持目视与数码成像二档分光切换，可同步完成肉眼观察与图像采集，操作便捷。

图1 LF500整机原厂实拍图

图2 24mm大视场目镜及三目观察筒结构实拍图

（2）可拆卸超长工作距离聚光系统，适配多规格培养载体

LF500搭载优化款超长工作距离聚光镜，常规工作距离72mm，数值孔径0.30，搭配非球面镜片与可调光阑，整视场光照均匀柔和，可满足常规6孔、12孔、24孔培养皿与培养板的明场、相衬、荧光观测需求。聚光镜支持完整拆卸，拆除后设备纵向操作空间可达160mm，可适配多层细胞工厂、大尺寸培养皿等高通量培养设备，支持细胞原位染色观测，无需转移细胞样本，减少样本损耗与污染风险。

图3 LF500超长工作距离可拆卸聚光镜结构实拍图

（3）模块化多通道LED荧光系统，适配双色活死染色成像

设备采用可快速拆装的模块化荧光激发盒，分为电动款与转盘式两款结构可选，最多可拓展7个荧光通道，标配DAPI、FITC、TRITC三组标准滤光片组，精准匹配Calcein绿色活细胞荧光、PI红色死细胞荧光的双通道成像波段。设备搭载宽光谱大功率LED荧光光源，支持亮度无级调节，即开即用无需预热，光源使用寿命长、维护成本低，光毒性较低，适配活细胞长时间观测。同时可根据实验需求定制Mcherry、CY5等专用滤光片，拓展多元荧光检测场景。

图5 LF500模块化快拆荧光激发盒实拍图

图6 多通道荧光通道切换面板实拍图

（4）大尺寸多功能柔性载物台，适配高通量样本定位

设备配备256×238mm大尺寸固定载物台，XY轴移动行程136×90mm，移动范围充足，可适配各类常规细胞培养容器。载物台采用同轴齿轮与丝杠传动结构，移动顺滑平稳，台面带有纵横刻度标记，便于96孔板等高通量样本的快速孔位定位。搭配低手位同轴柔性XY移动手柄，支持多方向摆动调节，操作姿态更贴合人体工学。台面预留多点拓展安装孔，可外接辅助设备，适配长期、批量的细胞活力检测实验，可拆卸移动尺可满足大型培养器皿的平整放置需求。

图7 LF500大尺寸多功能载物台实拍图

图8 低位柔性移动手柄结构细节实拍图）

（5）多模式观测兼容结构，丰富实验观测维度

设备搭载双向推拉式相差板，可同时搭载10X、20X、40X专用相差环，支持明场、相衬、荧光三种观测模式快速切换。染色前可通过相衬模式清晰观察细胞铺板密度、生长形态、贴壁状态，提前筛选合格样本；染色后可叠加明场、相衬、荧光多维度图像，同步获取细胞形态信息与活力数据，提升实验数据完整性。设备配置快拆装荧光护目板，可有效遮挡强激发光，降低光源对操作人员眼部的刺激，提升实验安全性。

图9 LF500双向推拉式相差板实拍图

（6）低位通光数码成像系统，适配低光荧光采集

设备采用左下倾式100%通光成像接口，相机安装后不会遮挡目视观测光路，兼顾目视观察与数码采集双重需求。成像通光率高，适配荧光低照度成像场景，可搭配230-2500万像素多规格高灵敏度显微相机，成像清晰度高、色彩还原度好。配套专业成像软件，可完成图像采集、保存、叠加、数据统计等基础操作，软件可定期迭代更新，适配不同实验的数据处理与归档需求。

图1 LF500低位同轴同步调焦手轮实拍图

图12 物镜转盘及防霉物镜组实拍图

二、实验前期准备

2.1 试剂与耗材清单

1. Calcein AM-PI活死细胞双色染色试剂盒；

2. 无血清细胞基础培养基、细胞培养基；

3. 无菌PBS磷酸盐缓冲液；

4. 6孔、12孔、24孔、96孔细胞培养板、细胞培养皿、细胞工厂；

5. 无菌离心管、移液枪、无菌吸头、避光孵育盒等常规实验耗材。

2.2 LF500显微镜上机调试步骤

1. 设备通电，依次开启机身总电源、透射LED照明光源、荧光激发系统电源，设备光源无需预热，开机即可投入使用。

2. 根据样本容器规格调整聚光结构：常规多孔板、小型培养皿保留聚光镜，利用72mm标准工作距离观测；细胞工厂等大型容器拆除聚光镜，使用160mm超大纵向空间，避免设备与样本磕碰。

3. 将相差板切换至空白档位，切换10X长工作距离相差物镜，调节低手位同轴调焦手轮，完成对焦归零与高程锁定。

4. 调试荧光系统，依次切换FITC、TRITC通道，将荧光亮度调节至基础档位，规避荧光信号过曝问题，保证成像画质均匀。

5. 根据样本规格安装对应载物托板，固定样本位置，检查设备各操作部件灵活性，完成上机前调试。

三、标准化实验操作全流程

3.1 细胞样本预处理

1. 取出完成药物处理、造模培养的细胞样本，缓慢吸除孔内原有细胞培养基，操作轻柔，避免冲刷损伤贴壁细胞。

2. 加入无菌PBS缓冲液轻柔洗涤细胞单层，清除残留血清成分，血清中的游离酯酶会提前分解Calcein AM，提升背景荧光，干扰成像效果。

3. 洗涤完成后吸净孔内残留PBS，避免残留液体稀释染色工作液，影响染色效果。

3.2 Calcein AM-PI染色工作液配制

染色工作液需现配现用，全程避光操作。以24孔板单孔250μL体系为例，取适量无血清培养基，分别加入Calcein AM母液与PI母液，稀释至实验常用浓度（Calcein AM 2-5μM、PI 1-2μM），轻柔吹打混匀后备用。

3.3 细胞避光孵育染色

1. 向预处理后的细胞孔内加入配制完成的染色工作液，确保液体覆盖细胞单层。

2. 将培养板放置于37℃避光孵育环境中，孵育15-30min，根据细胞类型可适当微调孵育时长。

3. 悬浮细胞可通过离心收集细胞沉淀，用染色工作液重悬后避光孵育，孵育完成后转移至培养皿上机观测。

3.4 LF500显微镜荧光成像操作

1. 样本放置：孵育完成后取出细胞样本，无需二次洗涤，平稳放置于LF500载物台，固定样本位置，避免观测过程中移位。

2. 相衬预定位：推拉相差板切换至对应物镜的相差环档位，开启透射光源，通过低手位调焦手轮粗调、微调，获取清晰的细胞形态视野，标记目标观测区域。

3. 绿色通道成像：启动荧光系统，切换FITC激发通道，缓慢调节荧光亮度，待细胞绿色荧光信号清晰、无明显背景干扰后，切换数码成像模式，采集活细胞荧光图像。

4. 红色通道成像：切换TRITC激发通道，匹配红色荧光成像亮度，采集死细胞细胞核荧光图像。

5. 多维度成像：通过设备成像系统叠加明场、相衬、双色荧光图像，直观区分活细胞、死细胞的分布状态；切换20X、40X物镜，可拍摄单细胞细节图像，用于精细化分析。

3.5 图像采集与细胞活力数据分析

1. 通过配套成像软件统一保存单通道荧光图像、多通道叠加图像，留存原始实验数据。

2. 依托软件图像分析功能，识别视野内绿色阳性活细胞、红色阳性死细胞，统计总细胞数、活细胞数量，计算细胞存活率。

3. 整理成像图片与数据报表，分类归档，便于后续实验复盘与数据对比分析。

四、设备操作规范与实验注意事项

1. 荧光染色样本对光线敏感，实验全程需做好避光处理，观测时荧光亮度由低档位逐步调节，减少荧光淬灭对成像效果的影响。

2. 观测大型细胞培养容器时，务必拆除聚光镜，预留充足纵向空间，防止物镜与样本碰撞，保护设备光学部件。

3. 实验过程中避免培养液、试剂滴落至物镜、载物台等光学部件，若出现液体残留，需用专用镜头纸轻柔擦拭清理。

4. 长时间活细胞动态观测时，可适当降低荧光光源亮度、缩短曝光时长，降低光源对活细胞的影响。

5. 批量样本检测时，可利用设备多通道荧光切换功能与载物台孔位标记，有序完成样本成像，提升实验效率。

6. 日常设备使用后，需清理载物台污渍，关闭光源与设备电源，做好设备防尘养护，延长设备使用周期。

五、Calcein AM-PI法与AOPI法应用差异对比

1. 细胞适配性：Calcein AM染料生物相容性较好，染色后的细胞可用于后续培养实验；AO染料存在一定生物毒性，染色后的细胞难以复用，仅适用于终点检测。

2. 成像精准度：Calcein AM标记细胞质，可同步观察细胞形态与活力状态，细胞碎片不会产生干扰信号；AOPI法标记核酸，游离核酸、凋亡小体易产生杂信号，对计数结果存在轻微影响。

3. 样本兼容性：搭配LF500超长工作距离结构，Calcein AM-PI法可适配细胞工厂、3D细胞球、类器官等厚层立体样本；AOPI法更适配悬浮细胞快速计数，对厚层样本观测适配性一般。

4. 实验拓展性：LF500多通道荧光系统可拓展多色荧光检测，Calcein AM-PI法可搭配DAPI等染料开展多重标记实验，适配多元化科研需求。

六、方案适用应用场景

1. 高校、科研院所细胞生物学实验：细胞氧化应激损伤、缺氧损伤、药物毒性干预等模型的细胞活力检测。

2. 生物医药研发领域：抗肿瘤药物、细胞保护类药物的细胞水平筛选与效果验证。

3. 干细胞与原代细胞研究：干细胞、原代培养细胞的活性鉴定与存活状态观测。

4. 高通量细胞培养检测：细胞工厂、多孔板批量培养细胞的活力筛查与质量把控。

5. 教学与检验领域：院校荧光成像教学实验、医疗卫生及检验检疫相关细胞检测工作。

七、LF500设备标准配置清单

1. LF500无限远独立校正光学倒置荧光显微镜主机（铝合金压铸机身）

2. 30°倾斜铰链式三目观察筒，瞳距48-75mm可调，屈光度可调

3. WF10X/24mm平场大视野目镜、对中望远镜

4. 长工作距离平场相差荧光物镜：4X、10X、20X、40X、60X

5. 可拆卸超长工作距离聚光镜，常规工作距离72mm，数值孔径0.30

6. 双向推拉式相差环板，适配10X/20X/40X相差观测

7. 多通道模块化荧光激发系统，标配DAPI、FITC、TRITC滤光组

8. 256×238mm大尺寸多功能载物台、柔性低手位移动手柄

9. 可调亮度LED透射照明系统，配套多规格滤色片

10. 5/6孔防霉物镜转盘，滚珠定位，切换精准

11. 高灵敏度显微成像相机（230-2500万像素可选）、成像分析软件

12. 快拆装荧光护目板、多规格培养容器适配托板

八、方案总结

莱特LF500倒置荧光显微镜依托稳定的压铸机身结构、24mm超大视场光学系统、超长可拆卸工作距离聚光结构、多通道模块化LED荧光系统，可良好适配Calcein AM-PI活死细胞双色荧光染色检测实验。整套方案覆盖样本预处理、染色孵育、设备成像、数据分析全流程，操作规范、适配性广。

设备可兼容常规培养板、大型细胞工厂、立体细胞样本等多种实验载体，兼顾基础教学与科研筛查需求，模块化设计可根据实验需求拓展功能，适配多领域细胞活力检测工作，具备较强的实用性与通用性。