CKX53倒置荧光显微镜活死细胞双色荧光染色（Calcein AM-PI法）检测解决方案

更新时间：2026-07-31

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CKX53倒置荧光显微镜在活/死细胞双色荧光染色
（Calcein AM / PI 法）检测中的应用解决方案

高效 · 高信噪比 · 规范化实验室活体细胞分析指南

一、应用背景与检测原理

在细胞生物学研究、药物筛选、组织工程及肿瘤学检测中，精准评估细胞活力与死存状态是基础且关键的实验环节。Calcein AM / PI 双色荧光染色法作为经典的细胞活性检测手段，能够同步区分活细胞与死细胞，具有高灵敏度与高直观性的特点。

1. 荧光探针作用机制

荧光染料	细胞穿透性	作用作用机制与靶点	激发/发射波长 (激发/发射)
Calcein AM (黄绿荧光)	透膜型 (细胞膜透过)	被活细胞内内源性酯酶剪切产生带强负电荷的Calcein，保留在胞质内发发强绿色荧光	Ex: 494 nm / Em: 517 nm (匹配 FITC/GFP 通道)
Propidium Iodide (PI) (红色荧光)	非透膜型 (死细胞膜损伤)	无法穿透完整活细胞膜，仅通过死细胞或膜受损细胞的质膜，与双链DNA嵌合发出红色荧光	Ex: 535 nm / Em: 617 nm (匹配 TRITC/Cy3 通道)

二、 CKX53倒置荧光显微镜核心硬件支撑

针对活/死细胞双色荧光标记检测中荧光信号弱、易淬灭、暗室操作繁琐等痛点，CKX53组织培养倒置显微镜提供了高度契合的技术方案：

1. 多通道电动荧光与长寿命大功率LED光源

CKX53配备多达5个荧光观察通道，标准荧光配置采用大功率LED集成光源与电动控制荧光通道转换。LED光源发光均匀稳定、色彩还原性良好，无需预热且使用寿命长。高透过、高截止度的带通滤色片镜组使得即便在较弱荧光信号下，亦能获得高对比度、高信噪比的清晰荧光图像。

2. “遮光板"设计，实现明亮环境下的高反差荧光观察

传统荧光显微镜观察强依赖暗室，而CKX53专有的遮光板（Lighting Shield）设计可有效阻挡环境杂散光线的干扰。实验人员无需频繁关闭实验室照明，直接在普通明亮环境下即可获取高反差的双色荧光图像；在需要相衬观察时，遮光板可快速移出光路，无缝切换观察模式。

3. 人体工程学与无菌超净台高度契合设计

CKX53机身紧凑轻便（重约7kg），表面具备防紫外涂层，可直接放入超净工作台内部并通过紫外灯照射消毒。较短的眼点到调焦旋钮距离、45度倾斜光路及前置电源控制开关，使细胞取样、调焦与图像采集过程自然流畅，大幅提升培养箱与显微镜之间的快速操作效率。

【CKX53 在双色荧光检测中的配置优势】
针对Calcein AM与PI的激发/发射光谱，CKX53标配的FITC（绿荧光）与TRITC/Cy3（红荧光）高灵敏带通滤光镜组可精确匹配，无光谱串道干扰。

配备CKX3-MVR机械载物台与通用标本夹，支持96孔板、培养皿及培养瓶的快速定位与平滑切换，旋转90度即可精准移动一个孔位。

三、活/死细胞双色荧光检测标准操作流程

为确保染色均匀度、避免活细胞荧光猝灭及获得定量级成像效果，推荐以下标准化应用流程：

步骤 1：试剂配制与样品准备

• 工作液配置：将 Calcein AM (储存液) 与 PI (储存液) 用无荧光背景的无血清培养基或无钙镁PBS按 1:1000 - 1:500 比例稀释，制成工作染色终浓度（Calcein AM 约 2 μM，PI 约 4 μM）。

• 样品准备：取待测贴壁或悬浮培养细胞（如96孔板或35mm培养皿中的细胞），用温育的PBS轻轻洗涤细胞1-2次，除去血清中酯酶成分对 Calcein AM 的干扰。

步骤 2：细胞染色与孵育

• 加入染色液：向细胞样品中加入适量配制好的 Calcein AM / PI 双染色工作液，确保覆盖细胞层。

• 避光温育：置于 37°C、5% CO₂ 培养箱中避光孵育 15–30 分钟。孵育完成后可直接进行观察（若背景较高，可用PBS轻轻洗涤一次）。

步骤 3：CKX53 显微镜快速上样与定位

• 放置样品：将培养板或培养皿置于 CKX53 载物台上，调节 CKX3-HOUN 通用标本夹固定。

• 明场/相衬定位：开启 LED 明场光源，利用 iPC 整合相衬系统（4X–40X物镜切换无需更换相衬环）快速寻找目标视野，完成对焦与细胞形态初检。

步骤 4：双色荧光成像采集

• 开启荧光模块：展开 CKX53 专有遮光板（遮挡明亮环境光）。

• 绿光通道 (Calcein AM)：切至 FITC 滤光镜组，调低LED激发强度，快速对焦并采集活细胞黄绿荧光图像（胞质发光）。

• 红光通道 (PI)：通过电动控制按钮切至 TRITC 滤光镜组，采集死细胞红色荧光图像（胞核发光）。

• 图像融合：借助显微镜相机控制软件进行通道叠加，获得双色融合对比图。

四、结果分析与图像数据评估

在 CKX53 的高质量光学系统下，Calcein AM / PI 双色染色呈现出清晰的形态学与荧光光谱特征：

观察通道	细胞状态与特征	CKX53 成像质量表现
FITC 通道 (Ex 494nm / Em 517nm)	活细胞胞质强绿荧光，细胞轮廓完整	大功率LED均匀照明，无边缘光衰；透光率高，活细胞形态细节与伪足清晰可见。
TRITC 通道 (Ex 535nm / Em 617nm)	死细胞 / 膜受损细胞胞核呈红荧光，胞质发光极弱	高截止带通滤色片有效抑制背景自发荧光，死细胞红核对比度显著，识别准确。
双通道 Fusion 叠加 / 相衬叠加	总体细胞活力评估同步计算活性率与受损率	相衬与荧光图谱叠加无位置偏移，相衬无晕光干扰（配合IVC/iPC模式），提供准确定量依据。

五、实验注意事项与显微镜维护建议

5.1 染色时间控制：孵育时间过长可能导致 Calcein 渗出胞外增加背景荧光，或 PI 少量被活细胞内吞造成误判，建议控制在 15–30 分钟内完成观察。

5.2 激发光源强度调整：利用 CKX53 的 LED 光源多档强度调控功能，在满足拍摄对比度的前提下尽量降低激发光功率，延长荧光抗淬灭时间。

5.3 紫外灭菌防护：CKX53 机身具备防紫外涂层，置于超净台内开启紫外灯灭菌前，请确保盖好物镜防护罩及目镜盖，保护光学镜头防老化。

5.4 清洁维护：载物台及透明中心板如沾染培养基或染色液，应用 75% 乙醇湿润无尘纸轻轻擦拭，避免有机溶剂滞留损蚀部件。