LF200倒置荧光显微镜活/死细胞双色荧光染色（AOPI 法）检测应用解决方案

LF200倒置荧光显微镜在活/死细胞
双色荧光染色（AO/PI 法）检测中的应用解决方案

基于一体化 LED 荧光激发与低手位高效操作的细胞活性评估指南

图 1：莱特 LF200 倒置荧光显微镜整机结构

一、 应用背景与 AO/PI 双色荧光检测原理

在细胞生物学、肿瘤学研究、原代细胞分离提取以及药物毒理学筛选中，精准鉴别活细胞与死细胞的比例是评估细胞生理状态的基础环节。吖啶橙（Acridine Orange, AO）与碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）联合使用的 AO/PI 双色荧光染色法，能够特异性鉴别细胞质膜完整性，在含有杂质、血细胞或细胞碎片的复杂原代样品中，相较于传统明场台盼蓝染色展现出更高的特异性与识别准确率。

1.1 AO 与 PI 双色荧光探针的作用机制

二、 LF200倒置荧光显微镜核心硬件与技术支撑

莱特 LF200 倒置荧光显微镜采用无限远独立校正光学系统与模块化紧凑机身设计，针对 AO/PI 荧光染色的激发与多通道观察提供了稳定的技术保障：

2.1 高度集成一体化 LED 荧光激发系统（手动/电动可选）

LF200 荧光激发盒采用光源与激发块一体化的高度集成设计。内置大功率 LED 光源，支持无级亮度调节，即开即用，消除了传统汞灯长时间预热与冷却等待的困扰。电动控制模式配有大尺寸显示屏显示通道信息，具备光强自动记忆与软件控制功能；最多可配置 5 通道组，标配 FITC（GFP）、TRITC（CY3）及 DAPI 三色模块，精确匹配 AO 与 PI 的激发发射光谱。

图 2：LF200 高度集成一体化 LED 荧光激发盒（带液晶显示与无级调光）

图 3：LF200 精确匹配的高透过率荧光滤光块组（FITC / TRITC / DAPI）

2.2 超长工作距离聚光系统与高通量适应性

LF200 配备旋转摆入摆出式及升降式聚光系统。聚光镜摆入时工作距离为 48–60mm，满足培养皿及多孔板的常规相衬观察；聚光镜摆出后，工作距离升至 172mm，可直接对高通量细胞培养器（细胞工厂）或高培养瓶内的细胞进行快速扫描与观察。

图 4：LF200 旋转摆入摆出式聚光镜（摆出后工作距离达 172mm）

2.3 低手位人体工程学设计与同轴挠性传动载物台

LF200 调焦手轮（微调精度 0.002mm）、光路切换拉杆及照明开关均位于低手位水平位置，配合 45° 倾斜的铰链式双目观察镜筒，有效缓解实验人员长时间观察带来的肩颈疲劳。载物台采用同轴挠性钢丝传动，移动平稳无齿条伸出，配有带凹槽的透明载物圆板，可直观观察物镜位置并防止液体溅污物镜。

图 5：低手位同轴调焦手轮（带刻度与扭矩调节）与左下倾数码接口设计

2.4 左下倾数码成像接口与高灵敏度显微相机

LF200 采用左下倾侧向数码接口，相机安装位置不遮挡目镜观察视角。接口具备 100% 通光率，适配低照度荧光信号采集；可搭配 230–2500 万像素高灵敏度显微相机，结合分析软件实现多通道叠加与自动化计数。

图 6：LF200 匹配的高灵敏度数码显微相机系统

三、 AO/PI 双色荧光检测标准解决方案流程

为了在 LF200 显微镜下获得低背景噪音、高信噪比及准确的计数结果，推荐按照以下规范化流程进行操作：

步骤 1：染色工作液配制与样品洗涤

• 工作液配制：使用无荧光背景的 PBS 缓冲液将 AO 与 PI 母液稀释成双染色工作液（推荐终浓度：AO 约 5–10 μg/mL，PI 约 10–20 μg/mL），现配现用并避光保存。

• 样品洗涤：取待测贴壁或悬浮细胞（或原代细胞悬液），用温育的 PBS 轻轻洗涤 1–2 次，消除培养基成分及杂质干扰。

步骤 2：样品混合染色与短时温育

• 混合染色：将 AO/PI 混合工作液与细胞悬液按 1:1 比例混合（或直接加至细胞培养孔中），使染色液充分覆盖细胞。

• 避光孵育：室温避光孵育 5–10 分钟。由于 AO/PI 与核酸结合迅速，建议在 20 分钟内完成上样与图像采集。

步骤 3：LF200 快速上样与相衬聚焦

• 放置样品：将染色后的血球计数板、载玻片或培养皿放置于 LF200 柔性移动尺载物台上，使用适配托板固定。

• 明场/相衬定位：开启暖色 LED 明场光源，转动相衬盘切入对应相衬环（10X 或 20X），利用低手位调焦手轮快速调整焦距，锁定代表性视野。

步骤 4：多通道荧光图像采集

• 切换 FITC 通道（活细胞）：通过电动/手动控制将荧光激发盒切换至 FITC 通道，开启 LED 荧光激发，采集绿色胞质/胞核荧光图像（绿色发光细胞为活细胞）。

• 切换 TRITC 通道（死细胞）：切换至 TRITC 通道，系统自动还原该通道预设光强，采集红色胞核荧光图像（红色发光细胞为死细胞/膜破损细胞）。

步骤 5：图像合成与存活率定量分析

• 数据传输与叠加：通过左下倾接口的数码相机传输图像，利用显微成像分析软件对 FITC 绿光通道与 TRITC 红光通道进行 Merge 叠加。

• 活性计算：统计全视野内绿光活细胞数（Live）与红光死细胞数（Dead），计算细胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、 典型图像结果与数据评估

在 LF200 高质量光学系统与高信噪比 LED 荧光光路支持下，AO/PI 染色呈现出清晰的形态学与荧光特征：

图 7：LF200 下采集的高信噪比细胞荧光图谱（亮视野与极低背景噪点）

五、 规范操作注意事项与设备保养建议

5.1 孵育时间严格控制：AO/PI 结合快速，混合后建议在 20 分钟内完成采集。若时间过长，可能导致 AO 浓度游离变化或 PI 被活细胞少量吞噬造成假阳性。

5.2 激发光功率适度调节：利用 LF200 荧光激发盒的无级调光与光强记忆功能，在拍摄对比度满足要求的前提下适当降低 LED 功率，延长荧光抗淬灭时间。

5.3 液体溅溢防范与清理：载物台圆板具备凹槽防护设计，若有培养液或染色液溢出，请及时用 75% 乙醇湿润的无尘纸轻轻擦拭，防止液体渗入下方镜头。

5.4 物镜与透镜维护：半复平场消色差物镜透镜表面需保持洁净，清洗时应用气吹去除灰尘，再用蘸有乙醇/醚混合液的无尘纸由中心向外擦拭。