ECLIPSE Ts2-FL倒置荧光显微镜在活死细胞双色荧光染色(AO-PI法)检测方案

更新时间：2026-07-30

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ECLIPSE Ts2-FL倒置荧光显微镜在活/死细胞
双色荧光染色（AO/PI 法）检测中的应用解决方案

基于 LED 复眼透镜均匀照明与遮光系统的规范化细胞活性分析指南

一、应用背景与 AO/PI 双色荧光检测原理

在细胞毒理学评估、原代细胞计数、原代组织消化及肿瘤学研究中，区分活细胞与死细胞是基础检测手段。吖啶橙（Acridine Orange, AO）与碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）联合使用的 AO/PI 双色荧光染色法，能够特异性鉴别带有质膜损伤的死亡细胞与质膜完整的存活细胞，尤其在含有大量杂质（如红细胞、细胞碎片）的原代样品中，比传统台盼蓝染色具有更高的特异性与准确度。

1.1 AO 与 PI 荧光探针的作用机制

荧光探针	膜穿透特性	胞内分子靶点与反应机制	激发/发射光谱及适配通道
吖啶橙 (Acridine Orange, AO) (绿色/黄绿荧光)	膜透过型 (脂溶性)	可穿透完整活细胞与死细胞膜，与双链DNA结合后发出强绿色荧光；与单链RNA结合发出橙红荧光	Ex: 488 nm / Em: 525 nm (匹配 GFP/FITC 绿光通道)
碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) (红色荧光)	非膜透过型 (仅透过受损膜)	无法穿透完整活细胞膜；仅当细胞死亡质膜破损时进入胞内，与双链DNA嵌合发出红色荧光（产生荧光共振能量转移抑制/遮盖绿光）	Ex: 535 nm / Em: 617 nm (匹配 TRITC/Texas Red 红光通道)

二、 Ts2-FL倒置荧光显微镜核心硬件与技术支撑

在双色荧光定量分析中，视野照度均匀性、信噪比以及操作便捷度直接决定了计数的精准性。ECLIPSE Ts2-FL 倒置荧光显微镜通过多项光学设计为 AO/PI 检测提供支撑：

2.1 LED 光源与内置复眼透镜，提供无边缘光衰的落射荧光

Ts2-FL 采用高亮度落射荧光 LED 光源，并在光路中内置复眼透镜（Fly-eye lens）。复眼透镜能够有效消除发光中心与边缘的照度差异，在视野范围内提供高度一致的光强分布，避免因视野边缘光衰导致活/死细胞荧光判读偏差。同时 LED 光源即开即用、无需中心校准。

2.2 遮光板（Shield Plate）技术，实现明亮实验室环境下的高对比度观察

针对常规荧光观察依赖暗室环境的局限，Ts2-FL 配备了可选的遮光板附件。遮光板能阻挡培养室中的室内杂散光，使实验人员在无需关闭室内照明的情况下，直接观察并采集高信噪比的 AO/PI 双色荧光图像。

2.3 通道光强自动记忆与噪声消除机制（Noise Terminator）

Ts2-FL 最多可安装 3 个落射荧光滤光块。当在 GFP/FITC 通道（观察 AO 标记活细胞）与 TRITC 通道（观察 PI 标记死细胞）之间切换时，系统能自动再现之前设定的各通道激发光亮度，无需频繁重新调节光强。这既提升了通道切换效率，又有效减缓了荧光探针的淬灭。集成的噪声消除机制可吸收额外杂散光，提高背景黑度与荧光对比度。

2.4 纤巧抗振机身与人体工程学控制面板

Ts2-FL 采用紧凑型流线机身（重约 13kg），具备优异的抗振特性，可轻松置于超净工作台内部。透射照明与落射荧光开关位于前面板，两侧分别配置透射与荧光亮度调节器，避免误操作。配合高性能机械载物台（TS2-S-SM）及多样化托板，可稳定承载多孔板、培养皿及血球计数板。

【Ts2-FL 在 AO/PI 双色检测中的光学优势】
CFI60 无限远光学系统：具备高数值孔径（NA）与长工作距离（WD），确保大视野下的高分辨率与光透过率。

切跖相差（APC）与浮雕反差（Relief Contrast）：在无荧光模式下，可使用切跖相差或浮雕反差对较厚标本或无染色细胞进行无眩光观察，快速寻找目标聚焦面。

三、 AO/PI 双色荧光检测标准解决方案流程

为确保 AO/PI 荧光染色的准确性、降低背景噪音并获得高重复性的检测结果，建议采用以下规范化应用流程：

步骤 1：试剂配制与样品准备

• 工作液配置：将 AO 与 PI 储存液用 PBS 缓冲液稀释配制成双染色工作液（建议终浓度：AO 约 5–10 μg/mL，PI 约 10–20 μg/mL），避光保存。

• 细胞样品准备：取待测贴壁或悬浮细胞，用温育的 PBS 轻轻洗涤，消除培养基成分及细胞碎片干扰。

步骤 2：细胞混合染色与温育

• 加入染色液：按 1:1 或推荐比例将 AO/PI 混合工作液加入细胞悬液（或直接加入培养孔内），使终浓度覆盖细胞。

• 室温避光孵育：室温下避光孵育 5–10 分钟。由于 AO/PI 结合迅速，需在 20 分钟内完成图像采集与计数。

步骤 3：Ts2-FL 快速上样与相衬定位

• 放置样品：将染色后的载玻片、血球计数板或培养皿置于 Ts2-FL 载物台上，使用 C-S-HU 通用托板或载玻片托板固定。

• 明场/相衬定位：开启透射 LED 光源，使用相差或浮雕反差模式（10X 或 20X 物镜）快速调整焦距，锁定代表性视野。

步骤 4：荧光通道切换与图像采集

• 展开遮光板：展开 Ts2-FL 专有遮光板，阻挡实验室环境光。

• GFP/FITC 通道（活细胞）：切换至绿光滤光块，开启落射荧光，系统自动再现预设光强，采集绿色胞质/胞核荧光图像（绿光细胞为活细胞）。

• TRITC 通道（死细胞）：切换至红光滤光块，采集红色胞核荧光图像（红光细胞为死细胞）。

步骤 5：图像叠加与定量数据分析

• 图像传输：通过 Side Camera Port 挂载的 Digital Sight 系列相机（如 DS-Fi2 / DS-Ri2）实时传输图像。

• 通道叠加与计数：利用 NIS-Elements 图像分析软件进行多通道叠加（Overlay/Fusion），自动或手动统计绿光与红光细胞数量，计算细胞存活率（Vitality %）。

四、典型图像结果与数据评估

在 ECLIPSE Ts2-FL 高品质光学系统的支撑下，AO/PI 双色染色呈现出清晰的形态学与荧光光谱特征：

观察模式/通道	标本荧光形态特征	Ts2-FL 成像优势表现
GFP / FITC 通道 (Ex 470-495nm)	活细胞质膜完整，胞质/胞核呈亮绿色荧光	复眼透镜确保视野中央与边缘照度一致；高透过滤光块清晰呈现活细胞形态与结构。
TRITC 通道 (Ex 530-550nm)	死细胞 / 膜受损细胞质膜受损，胞核呈现显著红色荧光	带噪声消除机制的滤光块有效抑制背景自发荧光，死细胞胞核红光边界清晰，判读准确。
双通道 Fusion 叠加 / 相衬叠加	综合存活率评估准确区分活细胞、死细胞及杂质	通道切换无焦平面偏移；遮光板保障明亮房间内高信噪比，为准确计数提供依据。

五、规范操作注意事项与设备保养建议

5.1 观察时间控制：染色混合后建议在 20 分钟内完成荧光观察与图像采集。孵育时间过长可能导致 AO 浓度变化或 PI 被活细胞内吞造成误判。

5.2 激发光功率控制：利用 Ts2-FL 的光强自动记忆功能，在满足图像拍摄强度的前提下适当调低 LED 激发功率，以减缓荧光漂白。

5.3 遮光板规范使用：在明亮室内操作时请确保遮光板置于光路上。遮光板及载物台表面若沾染染色液，应用湿润无尘纸擦拭干净。

5.4 镜片维护保养：高倍物镜（如 20X、40X）前透镜表面需定期检查，若沾有灰尘或培养基，应用气吹或专用的无尘纸沾取无水乙醇轻轻擦拭，保持优良的透光性能。