CKX53倒置显微镜荧光升级及活死细胞双色荧光染色（AOPI法）检测解决方案

OLYMPUS CKX53倒置显微镜荧光升级及
活/死细胞双色荧光染色（AO/PI法）检测应用解决方案

基于 CKX-UVBG-E 电动智能荧光模块的标准化细胞活性评估指南

图 1：加装 CKX-UVBG-E 电动智能荧光模块后的 OLYMPUS CKX53 倒置荧光显微镜整机结构

一、 方案背景与 AO/PI 双色荧光检测原理

在细胞生物学、组织工程、肿瘤学评估及原代细胞提取过程中，精准鉴别细胞存活状态是核心检测步骤。吖啶橙（Acridine Orange, AO）与碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）联合使用的双色荧光染色法，能够特异性标记质膜完整性。相较于传统台盼蓝明场染色，AO/PI 双色荧光法能够有效排除原代样品中的无核红细胞、细胞碎片及杂质干扰，展现出更高的检测特异度与识别准确率。

1.1 AO 与 PI 荧光探针的作用机制

二、 CKX53 倒置显微镜荧光升级方案（CKX-UVBG-E 模块）

常规奥林巴斯 CKX53 显微镜主要用于明场及相衬活细胞观察。通过加装专为 CKX53 量身开发的 CKX-UVBG-E 电动智能荧光模块，无需更换显微镜主体即可快速升级为高性能倒置荧光显微平台：

2.1 高度集成一体化与内陷槽紧凑安装设计

CKX-UVBG-E 模块将大功率 LED 光源与荧光激发块高度集成于单一盒体内，采用了内陷安装槽与壳体卡扣设计，结构紧凑且外部固定螺丝少。升级后荧光模块极薄，不遮挡载物台下方空间，确保物镜转换顺畅无阻。

图 2：CKX-UVBG-E 荧光模块在 CKX53 载物台下方的内陷式紧凑安装结构

2.2 电动智能通道切换与 1.44 英寸彩色大屏

模块配备 1.44 英寸彩色显示屏，以彩色方柱和百分比数值清晰显示当前通道状态及激发光亮度。实体按键与编码标记让通道切换一目了然；配合防滑指压旋钮，单指即可快速旋转与点击操控，极大提升了实验效率。

图 3：CKX-UVBG-E 1.44英寸彩色大屏与单指防滑多功能操控旋钮

2.3 长寿命 LED 光源与通道光强智能记忆

采用大功率 LED 光源（使用寿命 > 30000 小时），即开即用，无需传统高压汞灯繁琐的预热与冷却等待。系统支持多达 4 色独立荧光通道，内置通道光强记忆功能——当在 B 通道（检测 AO 绿光）与 G 通道（检测 PI 红光）之间切换时，模块能自动还原之前设定的光照强度，避免重复微调导致样本荧光淬灭。

图 4：CKX-UVBG-E 电动智能荧光模块外观与显示控制面板

2.4 低风噪主动循环散热与软件联动扩展

模块内置低风噪、低震动风扇进行主动循环风散热，有效保障 LED 灯珠与滤光片的温度稳定，防止光谱中心波峰漂移。同时，模块支持外部协议通讯与软件联动控制，可无缝对接电脑端的图像采集与分析软件。

三、 AO/PI 双色荧光检测标准解决方案流程

为确保升级后的 CKX53 显微镜在进行 AO/PI 双色检测时获得高信噪比与高重复性的数据，建议遵循以下标准化实施流程：

步骤 1：试剂准备与细胞样品洗涤

• 工作液配制：使用无荧光背景的 PBS 缓冲液将 AO 与 PI 母液稀释成双染色工作液（推荐终浓度：AO 约 5–10 μg/mL，PI 约 10–20 μg/mL），现配现用并避光保存。

• 样品洗涤：取待测贴壁或悬浮细胞，用温育的 PBS 轻轻洗涤 1–2 次，消除培养基成分及残余血清对荧光染色的干扰。

步骤 2：样品混合染色与短时温育

• 染色混合：将 AO/PI 混合工作液与细胞悬液按 1:1 比例充分混合（或直接加至细胞培养孔中），使染色液均匀覆盖细胞。

• 避光温育：室温避光孵育 5–10 分钟。由于 AO/PI 与核酸结合迅速，建议在 20 分钟内完成上样与图像采集。

步骤 3：CKX53 上样与明场/相衬快速定位

• 放置样品：将染色后的血球计数板或培养皿置于 CKX53 载物台上，使用 Universal Holder 固定。

• 相衬寻焦：开启 LED 明场光源，利用 iPC 整合相衬系统（4X–40X 切换无需换相衬环）快速寻找代表性视野并完成对焦。

步骤 4：电动智能荧光通道切换与采集

• B 通道采集（活细胞）：通过 CKX-UVBG-E 单指按键一键切换至 B 激发通道（FITC），LED 光源开启，采集绿色胞质/胞核荧光图像（绿光细胞为活细胞）。

• G 通道采集（死细胞）：按下按键快速切换至 G 激发通道（TRITC），智能还原预设红光功率，采集红色胞核荧光图像（红光细胞为死细胞/膜受损细胞）。

步骤 5：图像合成与细胞存活率定量评估

• 图像传输与叠加：通过相机接口将图像传输至电脑，利用配套分析软件对 FITC 绿光通道与 TRITC 红光通道进行 Overlay/Merge 通道叠加。

• 存活率计算：分别统计视野内的绿光活细胞数（Live）与红光死细胞数（Dead），计算细胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、 典型图像结果与数据评估

在 CKX53 优良光学系统与升级后 CKX-UVBG-E 模块的支撑下，AO/PI 双色染色呈现出分明的形态学与荧光光谱特征：

图 5：升级荧光系统后获取的高信噪比多色细胞荧光观察成果图谱

五、 规范操作注意事项与设备保养建议

5.1 染色观察时间控制：AO/PI 与核酸结合迅速，染色混合后建议在 20 分钟内完成观察。时间过长可能导致 AO 浓度游离变化或 PI 被活细胞少量吞噬造成假阳性。

5.2 LED 激发强度适度调控：充分利用 CKX-UVBG-E 模块的无级调光与光强记忆功能，在拍摄对比度满足的前提下适当调低激发功率，减缓荧光探针淬灭。

5.3 风扇风道防堵与清洁：保证荧光模块侧面主动散热风扇的风道通畅，避免遮挡，定期用干燥气吹清理风扇网罩灰尘。

5.4 镜片与部件擦拭维护：若载物台或物镜沾染培养基或染色液，应及时用 75% 乙醇湿润无尘纸轻轻擦拭，保持优良的透光性能与设备卫生。