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CKX53倒置显微镜荧光升级及活死细胞双色荧光染色（Calcein AM/PI法）方案

更新时间：2026-07-28

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OLYMPUS CKX53倒置显微镜荧光升级及
活/死细胞双色荧光染色（Calcein AM / PI法）检测应用解决方案

基于 CKX-UVBG-E 电动智能荧光模块的高效细胞活性评估指南

CKX53倒置显微镜荧光升级及活死细胞双色荧光染色（Calcein AM/PI法）方案

一、方案背景与 Calcein AM / PI 双色荧光检测原理

在细胞生物学、组织工程、药物筛选及肿瘤学研究中，精确评估细胞活力与死存状态是基础且关键的实验环节。Calcein AM（乙氧基甲基荧光素阿醋酸酯）与 Propidium Iodide（碘化丙啶，PI）联合使用的双色荧光染色法，能够同步对同一视野下的活细胞与死细胞进行特异性标记，具有高灵敏度与直观性强的特点。

1.1 双色荧光探针的作用机制

荧光探针	膜穿透特性	胞内分子靶点与反应机制	激发/发射光谱及 CKX-UVBG-E 适配通道
Calcein AM (活细胞标记)	细胞膜透过型 (脂溶性)	无荧光的 Calcein AM 穿透活细胞膜，被胞内内源性活性酯酶水解为带强负电荷的 Calcein，滞留于胞质内发出强绿色荧光	Ex: 470/35 nm / Em: 525/45 nm (匹配 B 激发组 / FITC)
Propidium Iodide (PI) (死细胞标记)	非膜透过型 (仅透过受损膜)	无法穿透完整活细胞膜；仅当细胞死亡或质膜破损时穿入胞内，与双链 DNA 嵌合发出红色荧光	Ex: 545/25 nm / Em: 605/65 nm (匹配 G 激发组 / TRITC)

二、 CKX53 倒置显微镜荧光升级方案（CKX-UVBG-E 模块）

常规奥林巴斯 CKX53 显微镜主要用于明场及相衬活细胞观察。通过加装专为 CKX53 量身开发的 CKX-UVBG-E 电动智能荧光模块，无需更换显微镜主体即可快速升级为高性能倒置荧光显微平台：

2.1 高度集成一体化与内陷槽紧凑安装设计

CKX-UVBG-E 模块将大功率 LED 光源与荧光激发块高度集成于单一盒体内，采用了内陷安装槽与壳体卡扣设计，结构紧凑且外部固定螺丝少。升级后荧光模块极薄，不遮挡载物台下方空间，确保物镜转换顺畅无阻。

CKX53倒置显微镜荧光升级及活死细胞双色荧光染色（Calcein AM/PI法）方案

2.2 电动智能通道切换与 1.44 英寸彩色大屏

模块配备 1.44 英寸彩色显示屏，以彩色方柱和百分比数值清晰显示当前通道状态及激发光亮度。实体按键与编码标记让通道切换一目了然；配合防滑指压旋钮，单指即可快速旋转与点击操控，极大提升了实验效率。

CKX53倒置显微镜荧光升级及活死细胞双色荧光染色（Calcein AM/PI法）方案

2.3 长寿命 LED 光源与通道光强智能记忆

采用大功率 LED 光源（使用寿命 > 30000 小时），即开即用，无需传统高压汞灯繁琐的预热与冷却等待。系统支持多达 4 色独立荧光通道，内置通道光强记忆功能——当在 B 通道（检测 Calcein 绿光）与 G 通道（检测 PI 红光）之间切换时，模块能自动还原之前设定的光照强度，避免重复微调导致样本荧光淬灭。

CKX53倒置显微镜荧光升级及活死细胞双色荧光染色（Calcein AM/PI法）方案

2.4 低风噪主动循环散热与软件联动扩展

模块内置低风噪、低震动风扇进行主动循环风散热，有效保障 LED 灯珠与滤光片的温度稳定，防止光谱中心波峰漂移。同时，模块支持外部协议通讯与软件联动控制，可无缝对接电脑端的图像采集与分析软件。

【CKX-UVBG-E 模块升级的核心优势】
多片透镜高效聚光系统：提供高强度且分布均匀的激发光斑，高品质带通滤光片确保独立通道荧光纯净明亮。

丰富通道选配：标配 UV（DAPI）、B（FITC/GFP）、G（TRITC/CY3）三色组，并可选配 Y（mCherry）、R（CY5）等，精准匹配 Calcein AM 与 PI 染料。

三、 Calcein AM / PI 双色荧光检测标准解决方案流程

为确保升级后的 CKX53 显微镜在进行 Calcein AM / PI 双色检测时获得高信噪比与高重复性的数据，建议遵循以下标准化实施流程：

步骤 1：试剂配制与细胞样品洗涤

• 工作液配制：使用无荧光背景的无血清培养基或 PBS 缓冲液将 Calcein AM 与 PI 储存液稀释成双染色工作液（建议终浓度：Calcein AM 约 2 μM，PI 约 4 μM），现配现用并避光保存。

• 样品洗涤：取待测贴壁或悬浮细胞（如 96 孔板或 35mm 培养皿中的细胞），用温育的 PBS 轻轻洗涤 1–2 次，消除培养基中血清酯酶成分对 Calcein AM 的干扰。

步骤 2：样品孵育与染色

• 加入染色液：向细胞样品中加入适量配制好的 Calcein AM / PI 双染色工作液，确保覆盖细胞层。

• 避光温育：置于 37°C、5% CO₂ 细胞培养箱中避光温育 15–30 分钟。孵育完成后可直接观察（若背景较高，可用 PBS 轻轻洗涤一次）。

步骤 3：CKX53 上样与明场/相衬快速定位

• 放置样品：将培养板或培养皿置于 CKX53 载物台上，调节 Universal Holder 通用标本夹固定。

• 相衬寻焦：开启 LED 明场光源，利用 iPC 整合相衬系统（4X–40X 切换无需换相衬环）快速寻找代表性视野并完成对焦与细胞形态初检。

步骤 4：电动智能荧光通道切换与采集

• B 通道采集（活细胞）：通过 CKX-UVBG-E 单指按键一键切换至 B 激发通道（FITC），LED 光源开启，快速对焦并采集活细胞黄绿荧光图像（胞质发光）。

• G 通道采集（死细胞）：按下按键快速切换至 G 激发通道（TRITC），智能还原预设红光功率，采集死细胞红色荧光图像（胞核发光）。

步骤 5：图像合成与细胞存活率定量评估

• 图像传输与叠加：通过相机接口将图像传输至电脑，利用配套分析软件对 FITC 绿光通道与 TRITC 红光通道进行 Overlay/Merge 通道叠加。

• 存活率计算：分别统计视野内的绿光活细胞数（Live）与红光死细胞数（Dead），计算细胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、典型图像结果与数据评估

在 CKX53 优良光学系统与升级后 CKX-UVBG-E 模块的支撑下，Calcein AM / PI 双色染色呈现出清晰的形态学与荧光光谱特征：

观察模式/通道	标本荧光形态特征	CKX53 升级后成像优势
B 激发通道 (FITC) (Ex 470/35nm)	活细胞胞质呈强黄绿荧光，质膜完整，细胞轮廓清晰	大功率 LED 高效聚光，全视野激发均匀；独立带通滤光片透光率高，活细胞形态细节与伪足清晰可见。
G 激发通道 (TRITC) (Ex 545/25nm)	死细胞 / 膜受损细胞质膜破损，胞核呈显著红色荧光，胞质发光极弱	光强记忆功能确保切换无延迟，高截止滤光片有效抑制背景自发荧光，死细胞红核对比度显著，识别准确。
双通道 Fusion 叠加 / 相衬 Overlay	综合存活率评估同步计算活性率与受损率	电动切换顺畅，多通道叠加无焦平面与位置偏离；相衬与荧光图谱无缝叠加，为准确定量提供依据。

五、规范操作注意事项与设备保养建议

5.1 染色时间控制：孵育时间过长可能导致 Calcein 渗出胞外增加背景荧光，或 PI 少量被活细胞内吞造成误判，建议控制在 15–30 分钟内完成观察。

5.2 LED 激发强度适度调控：充分利用 CKX-UVBG-E 模块的无级调光与光强记忆功能，在拍摄对比度满足的前提下适当调低激发功率，减缓荧光探针淬灭。

5.3 风扇风道防堵与清洁：保证荧光模块侧面主动散热风扇的风道通畅，避免遮挡，定期用干燥气吹清理风扇网罩灰尘。

5.4 镜片与部件擦拭维护：若载物台或物镜沾染培养基或染色液，应及时用 75% 乙醇湿润无尘纸轻轻擦拭，保持优良的透光性能与设备卫生。