CKX53倒置荧光显微镜在活/死细胞 双色荧光染色（AO/PI 法）检测解决方案

CKX53倒置荧光显微镜在活/死细胞
双色荧光染色（AO/PI 法）检测中的应用解决方案

高效 · 高信噪比 · 无菌超净台高度契合的标准化细胞活性检测指南

图 1：奥林巴斯 CKX53 组织培养倒置荧光显微镜整体结构

一、 应用背景与 AO/PI 双色荧光检测原理

在细胞生物学、药物筛选、肿瘤学评估及原代细胞提取过程中，精准鉴别细胞存活状态是核心检测步骤。吖啶橙（Acridine Orange, AO）与碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）联合使用的双色荧光染色法，能够特异性标记质膜完整性。相比于传统台盼蓝明场染色，AO/PI 双色荧光法能够有效排除原代样品中的无核红细胞、碎片及杂质干扰，具有更高的检测特异度与准确率。

1.1 AO 与 PI 荧光探针作用机制

二、 CKX53倒置荧光显微镜核心硬件与技术支撑

针对活/死细胞双色荧光标记检测中荧光信号易漂白、杂散光干扰及暗室操作繁琐等难点，CKX53 组织培养倒置显微镜提供了高度契合的技术支撑：

2.1 多通道电动荧光与长寿命大功率 LED 集成光源

CKX53 配备多达 5 个荧光通道观察能力，标准荧光配置包含大功率 LED 集成光源与电动控制荧光通道转换。LED 光源发光稳定、无预热等待且使用寿命长。匹配高透过高截止带通滤色片镜组（标配 FITC、TRITC、DAPI 镜组），即便在弱荧光信号下也可获取高对比度、高信噪比的图像。

图 2：CKX53 超净台无菌观察与紧凑便携机身设计

2.2 专有“遮光板"（Lighting Shield）设计，实现明亮环境下的荧光观察

传统荧光显微镜强依赖暗室环境，而 CKX53 专有的遮光板设计可有效阻挡外界光线干扰，增加荧光图像反差，使得实验人员无需关闭实验室照明，直接在明亮环境中即可获取清晰的 AO/PI 双色荧光图像。在需要相衬观察时，遮光板可轻易移出光路。

图 3：CKX53 专有遮光板（Lighting Shield）结构

2.3 整合相衬 (iPC) 系统与“反衬" (IVC) 3D 观察技术

CKX53 配备 iPC 系统，在 4X 到 40X 之间切换物镜时无需更换相衬环即可获得高反差相衬图像，大幅提升定位寻找视野的效率。此外，新研发的反衬（Inversion Contrast, IVC）技术利用更窄的景深，为透明细胞标本提供无光晕、无定向阴影的 3D 立体清晰图像。

图 4：CKX53 预对中 iPC 滑块与高级镜头组

2.4 超净台无菌适配与人体工程学设计

CKX53 重量仅约 7kg，外形紧凑且涂有防紫外涂层，可直接置于超净台内使用超净台紫外灯照射消毒。45 度角倾斜光路、前置电源开关与右侧光路切换钮，结合 CKX3-MVR 手动载物台（旋转 90 度即可移动 96 孔板一个孔位），使细胞取样、对焦及拍摄操作顺畅自然。

图 5：CKX53 灵活承载多孔板、培养皿及培养瓶的通用载物托架

三、 AO/PI 双色荧光检测标准解决方案流程

为确保 AO/PI 双色荧光染色的准确性、降低背景背景噪音并获得高重复性的定量结果，建议采用以下规范流程：

步骤 1：试剂配制与样品洗涤

• 工作液配制：用无荧光背景的 PBS 缓冲液将 AO 与 PI 母液稀释成双染色工作液（推荐终浓度：AO 约 5–10 μg/mL，PI 约 10–20 μg/mL），现配现用并避光保存。

• 样品洗涤：取待测贴壁或悬浮细胞（或原代细胞悬液），用温育的 PBS 轻轻洗涤 1–2 次，消除培养基成分及残余血清干扰。

步骤 2：样品混合染色与短时温育

• 混合染色：将 AO/PI 混合工作液与细胞悬液按 1:1 比例混合（或直接加至细胞培养孔中），使染色液充分覆盖细胞。

• 避光温育：室温避光孵育 5–10 分钟。由于 AO/PI 与核酸结合迅速，建议在 20 分钟内完成上样与图像采集。

步骤 3：CKX53 快速上样与相衬/IVC 区域定位

• 放置样品：将染色后的血球计数板、多孔板或培养皿放置于 CKX53 载物台上，调节 CKX3-HOUN 通用标本夹固定。

• 相衬寻焦：开启 LED 明场光源，利用 iPC 整合相衬系统（4X–40X 切换无需换环）或 IVC 模式快速对焦，锁定代表性目标视野。

步骤 4：遮光保护与双色荧光成像采集

• 展开遮光板：展开 CKX53 专有遮光板，直接遮挡室内环境光。

• FITC 通道（活细胞）：切换至 FITC 绿光镜组，开启大功率 LED 荧光，采集绿色胞质/胞核荧光图像（活细胞）。

• TRITC 通道（死细胞）：通过电动控制切换至 TRITC 红光镜组，采集红色胞核荧光图像（死细胞/膜受损细胞）。

步骤 5：图像融合与存活率定量评估

• 数据传输与叠加：通过标准相机接口将图像传输至电脑，利用控制软件对 FITC 与 TRITC 通道进行 Overlay/Fusion 通道叠加。

• 存活率计算：分别统计视野内的绿光活细胞数（Live）与红光死细胞数（Dead），计算细胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、 典型图像结果与数据评估

在 CKX53 高质量光学系统与高信噪比 LED 荧光光路支持下，AO/PI 染色呈现出清晰的形态学与荧光光谱特征：

图 6：CKX53 获取的高反差荧光观察成像图谱示例

五、 规范操作注意事项与设备保养建议

5.1 孵育时间控制：AO/PI 与核酸结合迅速，染色后建议在 20 分钟内完成观察。时间过长可能导致 AO 浓度变化或 PI 被活细胞少量内吞造成假阳性。

5.2 LED 激发强度调控：充分利用 CKX53 电动荧光系统的光源调控功能，在满足对比度的前提下适度调低激发功率，延长荧光抗淬灭时间。

5.3 无菌超净台紫外保护：CKX53 机身具备防紫外涂层，置于超净台开启紫外灯灭菌前，请盖好物镜防护罩及目镜盖，保护光学镜片防老化。

5.4 载物台与部件清洁：载物台透明中心板如沾染培养基或染色液，应用 75% 乙醇湿润无尘纸轻轻擦拭，避免有机溶剂残留损伤材质。